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檢測認證人脈交流通訊錄
小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 定量檢測試劑盒（ELISA） 說明書
- 【產品名稱】
通用名稱：小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 定量檢測試劑盒（ELISA）
英文名稱：Mouse Interferon γ (IFN-γ) ELISA KIT
【包裝規格】
48人份/盒，96人份/盒
【預期用途】
僅供科研使用，定量檢測血清、血漿、細胞培養上清液中小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 的濃度。
【檢驗原理】
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。在預包被抗小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 抗體（固相抗體，貨號：LT4030303C）的微孔酶標板中，加入小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 標準品（貨號：LT4030303J）、待測樣本和生物素化的檢測抗體（貨號：LT4030303K）。經過孵育，樣本中存在的 小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 與固相抗體和檢測抗體結合。經過洗滌去除未結合的組分，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(streptavidin-HRP)，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-酶標抗體的夾心復合物。洗滌后，加入顯色底物 TMB，避光顯色。底物在HRP催化下，產生藍色產物，在終止液作用下，最終轉化為黃色。在酶標儀上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 的濃度正相關。擬合標準品曲線，可以計算出樣本中小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 的濃度。
【主要組成成分】
主要成分
組分 48T規格 96T規格
標準品 1 vial 2 vial
預包被酶標板 96T 48T
檢測抗體 1 vial 1 vial
標準品稀釋液 5 ml 5 ml
HRP標記的鏈霉親和素 1vial 1vial
10×檢測緩沖液 5 ml 5 ml
顯色底物 TMB 10 ml 10 ml
終止液 10 ml 10 ml
20×濃縮洗滌液 30mL 30mL
說明書 1份 1份
自封袋 1個 1個
封板膜 3片 3片
需要但未提供的材料及耗材
1、能夠檢測 450 nm 吸光度的酶標儀，參考波長 570 nm 或 630 nm。
2、精密移液器及一次性吸頭
3、蒸餾水或去離子水
4、洗瓶或者自動洗板機
5、37℃水浴鍋或恒溫箱
6、1L量筒
7、無粉一次性乳膠手套
8、稀釋用聚丙烯試管
【儲存條件及有效期】
1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個月。
2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。
3、開封后，按照建議的條件保存，校準品、包被微孔板和HRP標記抗體，有效期為28天，其他成分在標簽標明的有效期內是穩定的。
【適用儀器】
半自動的酶標儀，如Thermo MK3，或者國產酶標儀。
【樣本要求】
樣本類型和采集
以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。
1、細胞培養上清：4000rpm條件下離心20min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復凍融。
2、血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在- 20℃以下，避免反復凍融。
3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復凍融。
樣本保存和穩定性
樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h，或者在- 20℃儲存6個月。樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。
【試劑準備】
檢測前請將所有的試劑、樣本恢復至室溫。
如果濃縮的試劑出現結晶，37℃溫浴，直至結晶全部溶解。
1×洗液
吸取 20×濃縮洗液 50 ml 至 1 L 的量筒，加蒸餾水或去離子水至 1000 ml，輕輕混勻，避免泡沫。
轉移至干凈瓶內。2 - 25℃貯存，1×洗液可穩定 30 天。
1×檢測緩沖液
吸取 10×濃縮檢測緩沖液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸餾水或去離子水至 50 ml，輕輕混勻，避免泡沫。
2 - 8℃貯存，1×檢測緩沖液可穩定保存 30 天。
檢測抗體
稀釋前充分混勻。根據標準品和待測樣本的數量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的檢測抗體。
注意：請在 30 分鐘內使用稀釋后的檢測抗體。
辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素
稀釋前充分混勻。
根據標準品和待測樣本的數量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。
注意：請在 30 分鐘內使用稀釋后的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。
樣本稀釋
如果樣本需要稀釋，請用試劑盒提供的 1×檢測緩沖液稀釋血清/血漿樣本，用細胞培養基稀釋細胞培養上清
小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 標準品
用蒸餾水或去離子水重溶小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 標準品，重溶體積標注在小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 標準品的標簽上。輕柔地渦旋震蕩，確保充分混勻，重溶后標準品的濃度為 2000 pg/ml。重溶后靜置 10 - 30 分鐘。稀釋前充分混勻。
請使用聚丙烯管進行標準品稀釋。
血清/血漿樣本標準曲線的制作：
取 200μl 濃縮的小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 標準品，加入 200 μl 標準品稀釋液，作為標準曲線的最高濃度 (1000 pg/ml)。在每一個試管中加入200 μl 標準品稀釋液。使用高濃度標準品做 1：1 系列稀釋。每次移液時，請確保充分混勻。以標準品稀釋液作為標準曲線的零濃度。
細胞培養上清樣本標準曲線的制作：
取200μl濃縮的小鼠γ-干擾素(IFN-γ) 標準品，加入 200 μl 細胞培養基，作為標準曲線的最高濃度 (1000 pg/ml)。在每一個試管中加入 200 μl 細胞培養基。使用高濃度標準品做 1：1 系列稀釋。每次移液時，確保充分混勻。以細胞培養基作為標準曲線的零濃度。
2000 pg/ml
【操作程序】
1、所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品、質控品和樣品按前面試劑準備中描述的方法配置好，并建議做復孔。
2、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
3.加入 350 μl 1×洗液靜置浸泡25 秒。為了獲得理想的實驗結果浸泡是必須的。棄掉洗液之后， 在吸水紙上將微孔板拍干。洗板完成之后，請立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。
4.每孔加入 50 μl 1×檢測緩沖液。
5.復孔加入 50 μl 2 倍倍比稀釋的標準品，空白孔復孔加入 50 μl 標準品稀釋液。樣本孔加入 50 μl樣本。
6.每孔加入 50 μl 稀釋的檢測抗體。保證步驟 4、5、6 連續加樣，不要間斷。加樣過程在 10 分鐘內完成。
7.使用封板膜封板。300 轉/分鐘振蕩，室溫孵育 2 小時。
8.棄掉液體，每孔加入 350 μl 洗液洗板，洗滌 5 次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實驗性能，必須徹底移除殘留液體。
9.每孔加入 100 μl 稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。
10.使用新的封板膜封板。300 轉/分鐘振蕩，室溫孵育 45 分鐘。
11.重復步驟 8。
12.每孔加入 100 μl 顯色底物 TMB，避光，室溫孵育 5 - 30 分鐘。
13.每孔加入 100 μl 終止液。顏色由藍色變為黃色。如果顏色呈現綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕叩擊板框，充分混勻。
14.在 15分鐘之內，使用酶標儀進行雙波長檢測，測定 450 nm 最大吸收波長和 570 nm 或 630 nm 參考波長下的 OD 值。校準后的 OD 值為 450 nm 的測定值減去 570 nm 或 630 nm 的測定值。僅使用 450 nm 測定會導致 OD 值偏高，并且準確度降低
【檢驗結果的解釋】
計算標準品和樣本的平均 OD 值，然后減去零濃度標準品的 OD 值。
檢測完成后，以標準品濃度做為縱坐標，對應的吸光度（OD值）作為橫坐標，利用計算機軟件，回歸分析確定最佳擬合曲線，創建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。
如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數，才是樣品的最終濃度
【檢驗方法的局限性】
1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。
2、在試劑盒標示的有效期內使用，過期產品不得使用。
3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。
4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。
5、如果樣本值高于標準曲線最高濃度，請用檢測緩沖液稀釋樣本，并重新檢測。如果細胞培養上清樣本需要較大的稀釋倍數，請用細胞培養基進行適度稀釋。
6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結果，檢測前，請排除該因素。
7、通過其他方法得到的檢測結果，與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。
【產品性能指標】
1、物理性能
試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣。
2、劑量反應曲線線性
校準品劑量反應曲線相關系數r值，大于等于0.9900。
3、精密度
批內精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內精度評估。批內變異系數CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。批間變異系數CV%小于15%。
4、靈敏度
最低檢出劑量小于6.3pg/ml。
5、回收率
三組已知的高、中、低濃度樣品，進行五次回收率評估，回收率在85%-115%之間。
6、特異性
本試劑盒識別天然和重組小鼠γ-干擾素(IFN-γ) ，與結構類似物無交叉。
穩定性
2℃-8℃保存，有效期6個月。
【注意事項】
生物安全
1、檢測必須符合實驗室管理規范的規定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。
2、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應，避免吸入煙霧與皮膚接觸。
3、底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護手套，實驗完成后徹底洗手。
4、試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護服，及防護眼睛、手及面部的設施。
5、本試劑盒用于科學研究，不能用于診斷治療。
6、請不要使用其他批號或其他來源的試劑替代本試劑盒中的試劑。
技術要點
1、重溶或者混合蛋白溶液時，避免起泡。
2、加標準品與樣本時，每個標準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。
3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。
4、底物溶液為無色液體，保存過程中變為藍色，代表底物溶液已經失效，不得使用。
5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產物，會瞬間變為黃色。
6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。
廢物處理
所有使用或未使用的試劑，所有污染性的一次性材料，應當遵循傳染性或潛在傳染性產品的處理程序，每個實驗室都有責任根據其實驗的類型和危險性級別，進行廢物和污物的處理，同時要嚴格依照有關規定對待所有的廢物和污物。
