急性經(jīng)皮毒性試驗，詢?nèi)珖鴻?quán)威機(jī)構(gòu)飛凡檢測認(rèn)證中心：一八七、二一九一、五四零四(王總)，地址：上海市豫園路750號。

1 范圍

本規(guī)范規(guī)定了動物急性皮膚毒性試驗的基本原則、要求和方法。 本規(guī)范適用于化妝品原料安全性毒理學(xué)檢測。

2 規(guī)范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 402, Feb. 1987 )

USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines （Series 870.1200， Aug. 1998 )

3 試驗?zāi)康?br />
急性皮膚毒性試驗可確定受試物能否經(jīng)皮膚吸收和短期作用所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，可為化妝品原料毒性分級和標(biāo)簽標(biāo)識以及確定亞慢性毒性試驗和其它毒理學(xué)試驗劑量提供依據(jù)。 4 定義

4.1 急性皮膚毒性（Acute dermal toxicity）：經(jīng)皮一次涂敷受試物后，動物在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。

4.2 經(jīng)皮LD50（半數(shù)致死量, Medium lethal dose）：經(jīng)皮一次涂敷受試物后，引起實驗動物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計學(xué)劑量。以單位體重涂敷受試物的重量(mg/kg或g/kg)來表示。

5 試驗的基本原則

受試物以不同劑量經(jīng)皮給予各組實驗動物，每組用一個劑量。染毒后觀察動物的毒性反應(yīng)和死亡情況。試驗期間死亡的動物要進(jìn)行尸檢，試驗結(jié)束時仍存活的動物要處死并進(jìn)行尸檢。若已知受試物具有腐蝕性或強(qiáng)刺激性可不進(jìn)行急性經(jīng)皮毒性試驗。

6 試驗方法 6.1 受試物

液體受試物一般不需稀釋。若受試物為固體，應(yīng)研磨成細(xì)粉狀，并用適量水或無毒、無刺激性、不影響受試物穿透皮膚、不與受試物反應(yīng)的介質(zhì)混勻，以保證受試物與皮膚有良好的接觸。常用的介質(zhì)有橄欖油、羊毛脂、凡士林等。 6.2 實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

可選用健康成年大鼠、家兔或豚鼠作為實驗動物，也可使用其它種屬動物進(jìn)行試驗。使用雌性動物應(yīng)是未孕和未曾產(chǎn)仔的。建議實驗動物體重范圍為：大鼠200g ~300g；家兔2kg ~3kg；豚鼠350g ~450g。實驗動物皮膚應(yīng)健康無破損。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應(yīng) 3d~5d時間。

實驗動物及實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。 6.３ 劑量水平

根據(jù)所選用的方法要求，原則上應(yīng)設(shè)4~6個劑量組，每組動物一般為10 只，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產(chǎn)生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進(jìn)行預(yù)試。如果受試物毒性很低，可采用一次限量法，即用10只動物（雌雄各半）皮膚涂抹5000mg/kg

體重劑量，當(dāng)未引起動物死亡，可考慮不再進(jìn)行多個劑量的急性經(jīng)皮毒性試驗。 6.4 試驗步驟

6.4.1 試驗開始前24h，剪去或剃除動物軀干背部擬染毒區(qū)域的被毛，去毛時應(yīng)非常小心，不要損傷皮膚以免影響皮膚的通透性。涂皮面積約占動物體表面積的10%，應(yīng)根據(jù)動物體重確定涂皮面積。體重為200g~300g的大鼠約為30cm2~40cm2，體重為2kg~3kg的家兔約為160 cm2~210 cm2,體重為350g~450g的豚鼠約為46 cm2~54 cm2。

6.4.2 將受試物均勻涂敷于動物背部皮膚染毒區(qū)，然后用一層薄膠片覆蓋，無刺激膠布固定，防止動物舔食。若受試物毒性較高，可減少涂敷面積，但涂敷仍需盡可能薄而均勻。一般封閉接觸24h。

6.4.3 染毒結(jié)束后，應(yīng)使用水或其它適宜的溶液清除殘留受試物。

6.4.4 觀察期限一般不超過14d，但要視動物中毒反應(yīng)的嚴(yán)重程度、癥狀出現(xiàn)快慢和恢復(fù)期長短而定。若有延遲死亡跡象，可考慮延長觀察時間。

6.4.5 對每只動物都應(yīng)有單獨(dú)全面的記錄，染毒第1 d要定時觀察實驗動物的中毒表現(xiàn)和死亡情況，其后至少每天進(jìn)行一次仔細(xì)的檢查。包括被毛和皮膚、眼睛和粘膜以及呼吸、循環(huán)、自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體運(yùn)動和行為活動等的改變。特別注意觀察動物是否出現(xiàn)震顫、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡、和昏迷等癥狀。死亡時間的記錄應(yīng)盡可能準(zhǔn)確。

觀察期內(nèi)存活動物每周稱重、觀察期結(jié)束存活動物應(yīng)稱重，處死后進(jìn)行尸檢。

6.4.6 對實驗動物進(jìn)行大體解剖學(xué)檢查，并記錄全部大體病理改變。對死亡和存活24h和24h以上動物并存在大體病理改變的器官應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

6.4.7 可采用多種方法測定LD50，建議采用霍恩氏法、上-下法、概率單位-對數(shù)圖解法和寇氏法等。 6.5 試驗結(jié)果評價

評價試驗結(jié)果時，應(yīng)將經(jīng)皮LD50與觀察到的毒性效應(yīng)和尸檢所見相結(jié)合考慮，LD50值是受試物毒性分級和標(biāo)簽標(biāo)識以及判定受試物經(jīng)皮膚吸收后引起動物死亡可能性大小的依據(jù)。引用LD50值時一定要注明所用實驗動物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等。評價應(yīng)包括動物接觸受試物與動物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)及其它毒性作用）的發(fā)生率和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。

毒性分級見表1。 7 試驗報告

試驗報告應(yīng)包括如下內(nèi)容:

（1） 受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；

（2） 實驗動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）；

（3） 實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號； （4） 所用劑量和動物分組，每組所用動物性別、數(shù)量及體重范圍； （5） 染毒后動物中毒表現(xiàn)和死亡情況及出現(xiàn)時間，大體解剖及病理所見； （6） 計算LD50的方法；

（7） 列表報告結(jié)果和計算LD50及其95%可信區(qū)間（建議的表格形式見表2 ）；

（8） 結(jié)論。