檢測(cè)概述

冬蟲(chóng)夏草具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)受損肝腎、鎮(zhèn)靜和抗疲勞等作用，冬蟲(chóng)夏草的化學(xué)成分復(fù)雜，近五年有關(guān)冬蟲(chóng)夏草化學(xué)成分測(cè)定方法的研究對(duì)象主要為核苷類、甘露醇、多種氨基酸、甾醇類及無(wú)機(jī)元素等。

檢測(cè)方法

近五年來(lái)冬蟲(chóng)夏草中核苷類、甘露醇、多種氨基酸等成分的檢測(cè)方法，其中包括高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、分光光度法等方法。

1、核苷類物質(zhì)的測(cè)定

核苷類物質(zhì)為冬蟲(chóng)夏草的主要活性成分之一，具有廣泛的生理功能，其中以蟲(chóng)草素、腺苷等具有明顯的藥理作用。近五年的測(cè)定方法主要為高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法。

1.1 HPLC方法測(cè)定

中藥成分非常復(fù)雜，HPLC因其具有各種分析柱、高選擇性和高靈敏度的檢測(cè)器，所以具備分離效能高、分析速度快、靈敏度高和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，所以成為中藥研究的最重要的分析方法。建立了冷凍保鮮冬蟲(chóng)夏草中尿苷和腺苷的HPLC測(cè)定方法。采用Waters sunfire色譜柱(4.6mm×250mm，4.6μm)，流動(dòng)相系統(tǒng)為乙腈和水的比例和體積流量的梯度洗脫程序，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。結(jié)果尿苷和腺苷的線性范圍分別為0.0340～0.340μg，0.00494～0.0494μg，平均加樣回收率分別為98.70%(RSD為0.48%)、97.39%(RSD為1.6%)。該方法簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確精密、重復(fù)性好，能用于冷凍保鮮冬蟲(chóng)夏草中腺苷和尿苷的同時(shí)測(cè)定。周偉平[2]等建立了采用Agilent EclipseXDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱同時(shí)測(cè)定西藏產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草中尿苷及腺苷的含量的方法，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫33℃。尿苷及腺苷的線性范圍為32.95～439.3μg/mL(r=0.9999)和3.486～46.48μg/mL(r=0.9999)，平均回收率分別為98.5%、95.6%，RSD值分別為1.8%和2.4%(n=6)。來(lái)自西藏的23批冬蟲(chóng)夏草中尿苷的含量在1.209～2.192mg/g范圍內(nèi)，腺苷含量在0.0838～0.884mg/g范圍內(nèi)。該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可快速測(cè)定冬蟲(chóng)夏草中尿苷和腺苷的含量，為控制西藏冬蟲(chóng)夏草的質(zhì)量提供參考依據(jù)。李秀敏[3]等建立了HPLC法測(cè)定中藥免疫調(diào)節(jié)方冬蟲(chóng)夏草中腺苷的含量的方法。采用C18色譜柱Hypers LDSC 18mm(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相水-甲醇(85：15)，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，進(jìn)樣量10μL，柱溫25℃。樣品預(yù)處理方法以在室溫下用體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇超聲波提取60min。結(jié)果冬蟲(chóng)夏草中的腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.097～0.582mg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系。腺苷平均加樣回收率為100.88%，RSD%=1.43%。該方法可用于中藥免疫調(diào)節(jié)方冬蟲(chóng)夏草中腺苷的含量測(cè)定。建立了冬蟲(chóng)夏草核苷類物質(zhì)的微量提取方法，在優(yōu)化的HPLC-UV色譜條件下，鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷和蟲(chóng)草素等5種冬蟲(chóng)夏草主要核苷類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品分離完全。精密度、穩(wěn)定性和回收率實(shí)驗(yàn)表明，用HPLC-UV方法即可定量分析冬蟲(chóng)夏草的核苷類有效成分。用該方法檢測(cè)到這5種核苷類物質(zhì)含量在冬蟲(chóng)夏草子座部分與其蟲(chóng)體部分之間以及冬蟲(chóng)夏草居群間存在顯著差異。結(jié)果表明冬蟲(chóng)夏草主要核苷類成分的有效定量分析方法的建立對(duì)冬蟲(chóng)夏草的品質(zhì)評(píng)價(jià)及質(zhì)量控制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，也為進(jìn)一步研究影響冬蟲(chóng)夏草品質(zhì)的因素并建立品質(zhì)評(píng)價(jià)體系奠定了基礎(chǔ)。

蟲(chóng)草素，-脫氧腺苷(-deoxyadenosine)為含氮配糖體的核酸衍生物，屬嘌呤類生物堿，是一種核苷類抗生素。蟲(chóng)草素具有抑制微生物生長(zhǎng)、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗炎等藥理作用，建立了測(cè)定北冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體中蟲(chóng)草素的高效液相色譜法。使用Eclipse XDB C18 (4.6mm×150mm，5μm)色譜柱，以水：甲醇：甲酸(95：4：1)為流動(dòng)相，流速為0.8mL/min，25℃下檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。結(jié)果表明蟲(chóng)草素的平均回收率為100.8%，RSD值1.88%，此方法簡(jiǎn)單、可靠。劉小芳[7]等建立了一種新的反相高效液相色譜方法，用于蛹蟲(chóng)草中腺苷和蟲(chóng)草素的定性定量分析。樣品經(jīng)水超聲提取，以終濃度20mmoL/L檸檬酸、40mmoL/L醋酸、20mmoL/L三乙胺的混合溶液-乙腈(體積比98：2)為流動(dòng)相，流速1.0mL/min，色譜柱Capcellpak C18(150mm×4.6mm，5μm)分離，柱溫40℃，進(jìn)樣量10μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。在此條件下，腺苷在1～1000μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限0.2μg/mL，回收率93.75%～96.90%，RSD為0.116%;蟲(chóng)草素在2～1000μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限0.2μg/mL，回收率92.03%～97.35%，RSD為0.104%。該方法樣品處理簡(jiǎn)便、分離度高、雜質(zhì)干擾小、回收率高、重復(fù)性好，能夠?qū)τ枷x(chóng)草中腺苷和蟲(chóng)草素進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。

1.2 毛細(xì)管電泳法測(cè)定

用聚甲基丙烯酸丁酯(PBMA)整體柱毛細(xì)管電色譜法測(cè)定冬蟲(chóng)夏草中胞苷和腺苷的含量。采用自制的PBMA電色譜整體柱(總長(zhǎng)為34.5cm，有效長(zhǎng)度26.0cm)，流動(dòng)相20mmoL/L硼砂水溶液(pH3.5)，運(yùn)行電壓15kV，壓力進(jìn)樣(6×105)Pa×0.1min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，內(nèi)標(biāo)溶液100μg/mL甲氧芐啶(TMP)溶液(乙醇-流動(dòng)相1：1為溶劑)。檢測(cè)結(jié)果為兩核苷在12.5～125mg/L線性關(guān)系良好。檢測(cè)限為(S/N=3)及定量限(S/N=10)分別為：胞苷2.14mg/L，7.14mg/L;腺苷1.88mg/L，6.25mg/L。兩核苷加樣回收率在97.2%～103.5%，RSD在0.9%～2.6%。應(yīng)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測(cè)定分別以冬蟲(chóng)夏草菌絲體粉和鹿茸血為主要原料制品中的多種核苷和堿基成分。對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，以20mmoL/L硼砂-15mmoL/Lβ-環(huán)糊精為緩沖溶液(pH=9.4)，分離電壓22kV，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，電動(dòng)進(jìn)樣為10kV、5s時(shí)，在10min內(nèi)同時(shí)分離測(cè)定了蟲(chóng)草素、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶、腺苷、次黃嘌呤、尿苷、鳥(niǎo)苷和肌苷。各組分在0.2～200μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限范圍0.07～1.67μg/mL。5個(gè)批次的冬蟲(chóng)夏草菌絲粉保健品中腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷5組分的定量結(jié)果分別在0.15～0.19mg/g、0.72～0.92mg/g、1.44～1.59mg/g、1.51～2.32mg/g和1.77～2.56mg/g范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率的范圍是82.83%～109.21%;2個(gè)批次的鹿茸血保健品中次黃嘌呤、尿苷的定量結(jié)果在36.55～49.97ug/mL和86.08～108.97ug/mL范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率的范圍分別是89.68%～96.79%和99.05%～102.81%。探索冬蟲(chóng)夏草不同的預(yù)處理方法，以便更好地反映冬蟲(chóng)夏草的譜圖信息。方法采用不同的預(yù)處理方法，比較操作方法和所得樣品溶液。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，在以下電泳條件及改進(jìn)索氏提取法所得譜圖峰形好，信息多。電泳條件：未涂漬彈性石英毛細(xì)管(75μm×60cm)，緩沖溶液40mmoL/L硼砂溶液，電泳電壓20kV;進(jìn)樣時(shí)間3s，室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。通過(guò)比較多種預(yù)處理方法，上述預(yù)處理方法操作簡(jiǎn)便，所得溶液澄清透明。對(duì)毛細(xì)管電泳法分離15種核苷類化合物所用的不同緩沖液體系進(jìn)行了系統(tǒng)比較，確定不同模式毛細(xì)管電泳法分析多種核苷類化合物的最適合背景緩沖液體系(BGE)。分別以四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉、乙酸銨和乙二胺(DEA)為背景電解質(zhì)，對(duì)毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細(xì)管電泳-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(CE-ESI-TOF/MS)以及膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳(MEKC)3種模式進(jìn)行比較，并對(duì)其中幾種優(yōu)勢(shì)緩沖體系進(jìn)行了優(yōu)化。建立了簡(jiǎn)單、快速測(cè)定冬蟲(chóng)夏草和人工蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草素、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷、次黃苷9個(gè)核苷及堿基類成分的高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法，比較天然冬蟲(chóng)夏草與人工蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中核苷及堿基類化合物的含量。方法采用未涂層熔硅彈性石英毛細(xì)管(75um×60.5cm，有效長(zhǎng)度50cm)，以pH9.0的0.05moL/L硼砂-硼酸(8：2，含硼酸根的濃度為0.2moL/L)作為緩沖體系，分離電壓20kV，溫度20，檢測(cè)波長(zhǎng)258nm，進(jìn)樣量為3.445kPa，進(jìn)樣5s。結(jié)果在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，冬蟲(chóng)夏草及人工蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中上述9個(gè)核苷及堿基類成分在15min內(nèi)達(dá)到基線分離;核苷及堿基類成分的濃度在1.0～205.5μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9995～0.9999，樣品回收率為95.3%～106.5%。結(jié)果表明人工蛹蟲(chóng)草子實(shí)體與天然蟲(chóng)草有相似的核苷及堿基成分，但在含量上有較大差異。新建的方法操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)消耗低，高效而快速，可以成為冬蟲(chóng)夏草及代用產(chǎn)品中核苷及堿基類成分檢測(cè)的一種簡(jiǎn)便、價(jià)廉、有效的分析方法。

2、氨基酸含量的測(cè)定

冬蟲(chóng)夏草中含蛋白質(zhì)20.06%～26.40%，由天門(mén)冬、蘇、絲、谷、脯、甘、纈、蛋、異亮、亮、酪、苯丙、賴、組、胱、半胱、精、色氨酸18種組成。以精氨酸、谷氨酸、色氨酸及酪氨酸等為藥理學(xué)主要成分，氨基酸是蟲(chóng)草補(bǔ)益強(qiáng)壯作用和增強(qiáng)免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，建立了一種快速測(cè)定冬蟲(chóng)夏草中氨基酸含量的HPLC方法。采用柱前鄰苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯聯(lián)合在線自動(dòng)衍生，二元梯度洗脫(流動(dòng)相A：40mmoL/LNaH2PO4、H2O，pH7.8、流動(dòng)相B：乙腈-甲醇-水=4.5/4.5/1，v/v)，反相C18短柱分離(Zorbax Eclipse AAA C18色譜柱、75mm×4.6mm，3.5μm)，二極管陣列檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)338nm、參考波長(zhǎng)390nm)和熒光檢測(cè)器(激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm)聯(lián)合檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果各氨基酸含量在4.5～1000μmoL/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)為0.9914～0.9997)，除蛋氨酸(部分氧化降解)為85.12%外，其他各氨基酸的加標(biāo)回收率為95.10%～103.29%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.03%～5.12%(n=5)。為研究冬蟲(chóng)夏草游離氨基酸的測(cè)定方法，利用液相色譜建立了冬蟲(chóng)夏草中游離氨基酸的分析方法。以0.1moL/L鹽酸為萃取劑，0.2mL1.0g/L的L-正纈氨酸為內(nèi)標(biāo)溶液，超聲萃取20min，以鄰苯二甲醛為衍生化試劑，WatersC18色譜柱進(jìn)行分離，熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。回收率94.62%～101.44%，RSD=1.06%～4.61%(n=6)。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適于冬蟲(chóng)夏草中游離氨基酸的分析。

3、其他成分的測(cè)定

3.1無(wú)機(jī)元素的測(cè)定

北冬蟲(chóng)夏草中無(wú)機(jī)元素，結(jié)果該方法的加標(biāo)回收率為97.5%～108.6%，RSD為0.10%～4.30%，檢出限為0.0004～0.0945mg/L，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)論北冬蟲(chóng)夏草中Cu、Mn、Mg、K、Fe元素含量較為豐富，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為北冬蟲(chóng)夏草中元素含量與其藥效的相關(guān)性提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

用ICP-AES測(cè)定了7產(chǎn)地人參、6產(chǎn)地鹿茸和4產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草中的P、B、Zn、Fe、Cu、Na、K、Mg、Mn、Ca10種元素的含量，比較了K與Na、Ca與Mg、Zn與Cu、Fe與Mn、P與B的含量比例關(guān)系。結(jié)果表明不同產(chǎn)地人參、鹿茸和冬蟲(chóng)夏草的10種元素的5個(gè)比例值存在顯著性差異。此結(jié)果可用來(lái)鑒定是否為原產(chǎn)地人參、鹿茸及冬蟲(chóng)夏草。

3.2甘露醇、麥角甾醇的測(cè)定

冬蟲(chóng)夏草藥材粉末經(jīng)甲醇超聲提取后，用RP-HPLC測(cè)定。采用Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水(98∶2);流速為1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為282nm。檢測(cè)結(jié)果麥角甾醇進(jìn)樣量在0.04272～0.4272μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，麥角甾醇的平均回收率為98.7%(n=6)。采用此方法測(cè)定冬蟲(chóng)夏草藥材中麥角甾醇的含量，方法靈敏、快速、準(zhǔn)確。采用水提回流離心的方法，提取分離人工培殖冬蟲(chóng)夏草中D-甘露醇，用高碘酸鈉與甘露醇反應(yīng)產(chǎn)生黃色的3，5-二乙酰-1，4-脫氫二甲基吡啶，在波長(zhǎng)412nm處測(cè)定其最大吸收。甘露醇濃度在10～50mg/L之間時(shí)，與吸光值有良好線性關(guān)系，線性方程為C=79.172x-0.0713，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。人工培殖冬蟲(chóng)夏草中D-甘露醇的含量分別為89.64mg/g

(2005年)、91.86mg/g(2006年)、94.71mg/g(2007年)、98.98mg/g(2008年)、97.50mg/g(2009年)、94.71mg/g(野生)和96.84mg/g(野生)。

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