蛋白印跡（Western blot）實驗

 

內(nèi)容簡介

Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。如檢測材料或者藥物對某個信號通路上蛋白靶點的影響，檢測對細胞內(nèi)某個特定蛋白的表達量。首先通過凝膠電泳將不同分子量大小蛋白進行分離，后續(xù)利用特異性抗體識別一定分子量大小的目的蛋白。

 

結(jié)果展示

 

上圖是通過Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白的表達情況

 

服務(wù)說明

送樣方式：

需要您提供1.    待測樣品（材料或者樣品處理后的細胞/蛋白，也可由我們代處理）。

            2.    提供待測樣品的一抗及其說明書（一抗一般為5ul，也可由平臺代購）。

            3.    其他所涉及的細胞、試劑盒以及生物耗材等平臺都可以有償提供。

 

服務(wù)周期：

具體按照實驗要求，一般為接受樣品后2-3周，具體實驗周期請預(yù)約前與工作人員溝通確認，謝謝！

 

收費說明：

項目	收費
蛋白提取	50-100/樣
檢測費用	800/張膜
試劑費用	依據(jù)實際訂購價格

 

交付內(nèi)容：

實驗報告、內(nèi)參蛋白和目的蛋白曝光膠片各一張。

 

服務(wù)簡介

Western Blot是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞或者組織樣本中的蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后目標蛋白與特有性一抗結(jié)合，再與辣根過氧化物酶（HRP）標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色，分析曝光條帶的位置和灰度分析獲知目標蛋白在樣本中的表達情況。該法結(jié)合了凝膠電泳和固相免疫測定兩種技術(shù)的高特異性和高敏感性，可以對目標蛋白進行定型和半定量的分析。

蛋白分子量測定

 

內(nèi)容簡介

蛋白分子量測定（2W以下的用MALDITOF/，2萬以上的用SDS凝膠電泳）

SDS是十二烷基硫酸鈉的簡稱，它是一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，其數(shù)量遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而使其電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，根據(jù)標準蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)和遷移率所作的標準曲線，可求得未知物的分子量。

優(yōu)缺點：實驗成本較低，儀器設(shè)備也相對很簡單，一套電泳裝置即可。但是精確程度相對較低，好的電泳圖譜需要一定的技術(shù)。 

 

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-MS）是將待測物懸浮或溶解在一個基體中，基體與待測物形成混晶，當基體吸收激光的能量后，均勻傳遞給待測物，使待測物瞬間氣化并離子化。基體的作用在于保護待測物不會因過強的激光能量導致化合物被破壞。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，檢測離子。

優(yōu)缺點：（1）同ESI-MS 一樣對樣品的消耗很少；（2）隨著質(zhì)量分析器的不斷改進、新的基質(zhì)的不斷發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用以及延遲萃取技術(shù)的使用，使得MALDI-MS 的最高分辨率不斷提高，甚至超過ESI-MS；（3）MALDI-MS 單電荷峰占主要部分，碎片峰少，非常有利于對復(fù)雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮發(fā)成分，降低了對樣品預(yù)處理的要求；（4）MALDI-TOF 質(zhì)譜對生物大分子分子量的測定范圍是所有測試技術(shù)中最廣的。

 

 

服務(wù)說明

需要您提供：

1. 蛋白大概分子量信息。

2. SDS-page需要使用的marker信息。

測試周期：收到樣品1周左右時間出數(shù)據(jù).

測試設(shè)備：凝膠電泳儀，MALDI-TOF 質(zhì)譜儀

 

酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測試

內(nèi)容簡介

ELISA介紹

ELISA實驗是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。

在這種測定方法中有3種必要的試劑：1.固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）2.酶標記的抗原或抗體（標記物）3.酶作用的底物（顯色劑）

測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。

其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。用分光光度計（酶標儀）加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強。

 

測試過程（以試劑盒為例）

1.    加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

2.    溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育30分鐘。

3.    配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備。

4.    洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

5.    加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

6.    顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 分鐘。

7.    終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

8.    測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

 

結(jié)果展示

提供：原始數(shù)據(jù)；簡單數(shù)據(jù)處理和繪圖；

 

服務(wù)說明

樣品準備要求：

1.所檢測蛋白測試的試劑盒（也可以由公司代購）；

2.所檢測的樣品；

 

服務(wù)簡介

ELISA檢測是免疫檢測中的一項重要技術(shù)，該法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及可自動化操作等特點。目前已廣泛應(yīng)用于臨床檢測及研究領(lǐng)域。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。ELISA方法也合適用于經(jīng)mRNA表達譜芯片、蛋白芯片或蛋白質(zhì)組學（質(zhì)譜）等實驗找出差異蛋白后，進一步驗證差異蛋白。

 

檢測項目

提供間接法ELISA檢測、夾心法ELISA測定和競爭法ELISA測定，以及ELISA試劑盒訂購，組織樣本勻漿。

間接法ELISA檢測：

用特異性抗原包被固相載體，加入待測的抗體樣品反應(yīng)后，再加入酶標二抗，經(jīng)底物顯色后測定。

夾心法ELISA檢測：

用第一抗原或抗體包被固相載體，加入待測的抗體或抗原反應(yīng)后，再加入酶標的第二抗原或抗體，經(jīng)底物顯色后測定，即可計算出待測抗原的量。此方法所用抗原一般為大分子抗原，如蛋白等，不適用于多肽等半抗原。

競爭法ELISA檢測：

用特異性抗體包被固相載體，同時加入酶標抗原和待測抗原的混合物樣本，待測抗原將與酶標抗原競爭與固相上抗體結(jié)合。經(jīng)底物顯色后測定，計算兩組數(shù)值之差即可推出待測抗原的量。此方法常用于測定小分子抗原。

 

樣品要求

1. 客戶提供含待測樣品的標本（血清、血漿等），我們根據(jù)客戶的需要（定性、定量）制定技術(shù)服務(wù)路線。
2. 需提供待檢測抗體和包被用抗原。
3. 檢測的樣本為細胞培養(yǎng)上清、人和動物的血清、血漿時，樣本收集后應(yīng)立即-20度保存，若長期保存應(yīng)-80度保存。
4. 樣本量的要求：若一個指標做復(fù)孔檢測應(yīng)不少于250ul，做單孔檢測應(yīng)不少于120ul。建議若客戶樣本量充足最好提供500ul以上。
5. 客戶的樣本收集后，立即按要求保存，切忌反復(fù)凍融。外地客戶郵寄需要用干冰運輸，郵寄前請與技術(shù)支持溝通確認。